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聚碳酸酯膜作为载体的一大应用
   聚碳酸酯膜径迹蚀刻膜是由高品质的聚碳酸酯薄膜制成,孔径,流速快,不吸附蛋白和提取物,对样品无污染,具有良好的耐化学性和热稳定性,适用于大多数样品,膜表面光滑而平整,便于对截留物粒子进行观察,可提供黑色膜,用于荧光和其他显微镜法,背景反差大。

  聚碳酸酯膜性质和优点

  与固形物颜色不接近,背景反差大,利于用显微镜观察。

  可靠的表面吸附,方便样品分析、缩短分析时间。

  有完全透明的膜,吸附很低,不吸潮。

  皮重低,没有颗粒脱落物,超净过滤,生物学惰性。

  聚碳酸酯膜一个比较典型的应用就是作为载体,本文介绍的是采用了微孔聚碳酸酯膜作为EC和SMC共培养的载体,该模型可以模仿体内EC和SMC的组织结构关系,在此基础上,利用倒置显微镜和透射电镜观察了两种细胞的生长情况和细胞间缝隙连接情况,为下一步研究两者间的电生理活动提供了保障。

  注意:EC,即endothelial cell 血管内皮细胞。SMC,即smooth muscle cell 和平滑肌细胞

  一、材料和方法

  (1)材料。牛主动脉取自健康屠宰小牛;SD大鼠仔鼠(第四军医大学实验动物中心);1640培养基(Gibco);加强小牛血清(Hyclone);聚碳酸酯膜(10mm×15mm,厚12μm,孔径5μm,孔密度2800 mm-2 ,Millipore公司);2g L-1 明胶(Gibco).

  (2)方法

  1.牛主动脉EC(BAEC)和仔鼠SMC的分离和鉴定 按我们已建立的方法培养并鉴定牛主动脉EC和仔鼠胸主动脉SMC[7] ,利用2~5代细胞进行实验。

  2.EC和SMC的共培养 ①聚碳酸酯膜的准备:取聚碳酸酯膜0.15MPa20min高压消毒后备用,用前用明胶包被,培养箱内孵育3h,PBS浸洗后接种细胞;②共培养:按密度1×104 cm-2 将内皮细胞接种于聚碳酸酯膜的一侧,常规培养24h后翻转聚碳酸酯膜,将平滑肌细胞接种于膜的另一侧,24h后换液,以后每日换液1次,常规倒置显微镜观察,取接种后1,3和4d共培养标本进行透射电镜观察.

  3.透射电镜(TEM)标本的准备[8,9] 取出两侧长有细胞的聚碳酸酯膜,用预热的PBS漂洗,然后在含25g L-1 戊二醛,0.1mol L-1 二甲胂酸钠溶液(pH7)里固定1h,20℃,再用10g L-1 四氧化锇固定1h,20℃,用1g L-1 的鞣酸染色,1h,20℃,来加强对比,然后用梯度乙醇逐级脱水,之后把标本浸于乙醇-EPON(1 1)中,1h,20℃,zui后用EPON-环氧树脂包埋.用刀片将包埋块切成小块,垂直细胞层作超薄切片,用150目碳包被的铜网收集,然后用100g L-1 醋酸双氧铀和4g L-1 柠檬酸铅染色.

  二、结果

  1.SMC和EC在聚碳酸酯膜上生长情况,细胞在接种2h后开始在膜上贴附延伸,接种1d后EC逐渐融合,呈单层生长,细胞呈多边形.SMC在接种1d后细胞之间开始融合,对数生长,至第2日可见SMC融合,EC外形呈明显伸长改变,细胞边界清楚。第3日SMC开始出现细胞分层生长,EC生长减慢.至第4日时两种细胞出现衰退现象。

  2.SMC和EC在聚碳酸酯膜上同类和异类细胞间缝隙连接形成的超微结构 透射电镜结果显示,共培养1d后的EC和SMC在膜上呈单层生长状态,可观察到EC之间的缝隙连接(Fig1),聚碳酸酯膜孔内可见细胞突起(Fig2),EC和SMC通过微孔之间形成缝隙连接(Fig3),在缝隙连接形成处可见两个细胞的质膜互相靠拢,其间有2~3nm的缝隙,其中可见电子密度较高的颗粒组成的虚线状结构。

  共培养后第3日时,可以看到EC穿过微孔生长到膜的另一侧(Fig4),到对侧与SMC形成缝隙连接,且缝隙连接形成的多少与共培养的时间有关,经过电镜观察到在接种SMC1d后,穿过微孔的EC有30%~40%可以与对侧的SMC形成缝隙连接,而在第3日就可以达到70%~80%。还可以观察到SMC呈现多层生长现象(Fig5),至第4日时SMC明显发生退变,底层SMC开始分解(Fig6)。

  聚碳酸酯膜还有其他的应用,更多详情咨询!

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